Nguyễn Văn Thoan, Trần Thị Thu Hiền, Nguyễn Duy Thuần, Phương Thiện Thương

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 32, Số 2 (2016) 26-31

---

Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá tác dụng chống viêm cấp và mạn của hợp chất ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl acetate (CT1) phân lập từ cây khổ sâm cho lá bằng các mô hình thực nghiệm. Ở mô hình gây phù bàn chân chuột cống bằng carrageenan, chất CT1 (liều uống 50 mg/kg/ngày) có tác dụng làm giảm phù bàn chân chuột 24,73% (p<0,05) tại thời điểm 5 giờ sau khi gây viêm. Trên mô hình đánh giá tác dụng làm giảm khối u mạn gây bằng bông trên chuột cống trắng, chất CT1 (liều uống 25 mg/kg/ngày) có tác dụng làm giảm khối lượng u hạt 24,67% (p<0,05). Các kết quả thu được chứng minh rằng chất CT1 có tác dụng chống viêm và gợi ý rằng đây có thể là hoạt chất của dược liệu khổ sâm cho lá khi sử dụng làm thuốc chống viêm, chống dị ứng trong y học dân gian.

---

1. Đặt vấn đề

Trong số các cây thuốc được nhân dân các dân tộc nước ta sử dụng, có rất nhiều loài còn chưa được nghiên cứu đầy đủ về thực vật học, thành phần hóa học và tác dụng sinh học. Đặc biệt có nhiều loài còn là loài đặc hữu của Việt Nam là đối tượng rất tiềm năng cho nghiên cứu và phát triển thuốc. Trong số này, cây thuốc
khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.) được nhân dân các nơi sử dụng làm thuốc chống viêm loét dạ dày, mẩn ngứa, ghẻ lở [1-4].

Hình ảnh cây Khổ sâm cho lá

Qua quá trình thăm dò bước đầu, chúng tôi phát hiện thấy cây thuốc này còn có tác dụng ức sự sưng viêm, do đó có tác dụng giảm đau khi thử trên các mô hình in vitro. Đặc biệt, thành phần hóa học chính của khổ sâm cho lá là một diterpenoid nhóm ent-kauran là ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl acetate (ký hiệu là CT1) cũng cho tác dụng chống viêm rất mạnh trên mô hình thử in vitro [5-8], gợi ý rằng chất này chính là hoạt chất mang lại tác dụng chống viêm của dược liệu này. Tuy nhiên đến nay chưa có nghiên cứu nào đánh giá về các tác dụng chống viêm, giảm đau của hợp chất chính phân lập được trên mô hình in vivo.

Do đó, chúng tôi đặt vấn đề đánh giá tác dụng chống viêm cấp và mạn tính của diterpenoid CT1 từ cây khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.)” bằng mô hình gây viêm trên chuột cống.

2. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.1. Nguyên vật liệu

Chất CT1 (ent-7β-hydroxy-15-oxo kaur-16- en-18-yl acetat) được phân lập và xác định cấu trúc như đã mô tả trong nghiên cứu trước đây phân lập được có độ tinh khiết cao (nhiệt độ nóng chảy ổn định, độ tinh khiết 96% tính theo phần trăm diện tích pic trên máy HPLC, được thể hiện trên phổ 1H và 13C-NMR) [9].

Các hóa chất dùng cho thử tác dụng sinh học gồm: carrageenan (Sigma Aldrich), indomethacin (chuẩn phân tích), prednisolon (Jenapharm), nước muối sinh lý (B/Braun), dung dịch chống thấm đo viêm (Ugo Basile, Italia), amian tiệt trùng các hóa chất dùng để pha dung dịch đệm đều đạt chuẩn cho thử tác dụng sinh học.

2.2. Động vật

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, khỏe mạnh, nặng 18-22 g, được cung cấp bởi Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương dùng để đánh giá độc tính cấp. Chuột cống trắng chủng Wista, giống đực, khoảng 8 tuần tuổi, cân nặng 140-180 g, do Học viện Quân y cung cấp. Động vật được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí
nghiệm 5 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu. Thức ăn do Viện Vệ sinh dịch tễ TW cung cấp, uống nước tự do.

2.3. Đánh giá độc tính cấp của chất CT1

Độc tính cấp của dược liệu và của chất phân lập được thử trên chuột theo phương pháp do Bộ Y tế ban hành [10]. Độc tính cấp của chất phân lập được biểu diễn bởi giá trị LD50, được hiểu là giá trị làm chết 50% số chuột thí nghiệm. Giá trị LD50 được tính theo phương pháp Behrens-Karber [10].

2.4. Đánh giá tác dụng chống viêm cấp

Tác dụng chống viêm cấp của chất phân lập được thử bằng mô hình gây phù bằng carrageenan theo Winter trên chuột cống trắng [10, 11].

Chuột thí nghiệm được chia ngẫu nhiên thành 4 lô, mỗi lô 10-12 con, gồm có

• Lô chứng (lô 1): được cho uống dung môi (nước muối sinh lý)
• Lô đối chiếu (lô 2): uống thuốc đối chiếu (indomethacine)
• Lô 3: uống chất CT1 ở liều lần lượt là 25 mg/kg cân nặng/ngày.
• Lô 4: uống chất CT1 ở liều lần lượt là 50 mg/kg cân nặng/ngày.

Chuột được uống dung môi hoặc thuốc thuốc nghiên cứu hàng ngày vào một giờ nhất định, trong 7 ngày trước khi làm thực nghiệm. Thuốc đối chiếu chỉ dùng vào ngày làm thực nghiệm. Ngày thứ 7, đo thể tích bàn chân sau phải chuột sau khi uống thuốc. Ngay sau đó tiêm dung dịch carrageenan 1% trong nước muối sinh lý (0,05ml/ chuột) vào dưới da gan bàn chân sau phải của chuột để gây viêm. Đo thể tích bàn chân sau phải của chuột vào thời điểm 3 giờ và 5 giờ sau khi tiêm carrageenan.

2.5. Đánh giá tác dụng chống viêm mạn

Tác dụng chống viêm mạn được thử theo mô hình gây u hạt thực nghiệm trên chuột cống trắng [10, 12]. Chuột được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 10-12 con, gồm có:

• Lô chứng (lô 1): uống dung môi
• Lô đối chiếu (lô 2): uống thuốc đối chiếu (prednisolon)
• Lô thử (lô 3-5): uống thuốc nghiên cứu ở các liều khác nhau.

Các chuột được gây mê, cạo lông ở lưng và sát trùng bằng ethanol 70%. Rạch và đặt ở dưới da một viên gạc bông có tẩm carrageenan vào cả hai bên xương bả vai. Chuột được uống dung môi hoặc thuốc thuốc nghiên cứu hàng ngày vào một giờ nhất định, trong vòng 7 ngày trước khi làm thực nghiệm.

Ngày thứ 8, giết chuột, bóc tách u hạt và cân. Kết quả được tính dựa trên trọng lượng khô thực của u hạt thực nghiệm, so sánh giá trị trọng lượng khô thực u hạt trung bình của lô dùng thuốc so với lô chứng và tỷ lệ % ức chế u hạt của lô thử so với lô chứng bệnh lý.

2.6. Tính toán kết quả

Các số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê theo phương pháp thống kê sinh học, sử dụng công cụ Data analysis của Microsoft Excel.

3. Kết quả

3.1. Độc tính cấp của chất CT-1

Độc tính cấp của chất CT-1 được thử trên chuột nhắt trắng, trọng lượng 18-20 g, cả đực cả cái. Kết quả thử được trình bày ở Bảng 3.9. Khi cho chuột uống liều đến 4,0 g bột CT- 1/ kg thể trọng chuột, tất cả các chuột đều khỏe mạnh, hoạt động, ăn uống, bài tiết bình thường, không có chuột chết. Khi cho chuột uống tăng liều lên đến 5,0; 6,25; 7,80; 9,75; 12,2 g bột/ kg thể trọng thì đa số các chuột có biểu hiện phân lỏng, một số chuột bắt đầu có biểu hiện co giật sau 24 giờ, 4 chân cứng đờ, có những chuột qua được cơn co giật, một số chuột chết rải rác sau 1, 2, 3 ngày uống thuốc. Ở liều càng cao thì chuột chết càng nhanh. Những chuột còn sống sót vẫn hoạt động, bài tiết bình thường, lúc đầu ăn uống ít hơn, sau đó thì bình thường. Kết quả được trình bày ở bảng 1.

Theo công thức tính được LD50 = 6,925 ± 0,537g bột/kg thể trọng chuột ở P = 0,05. Mặc dù chất CT-1 có độc khi thử trên chuột nhắt trắng, nhưng việc không thấy có chuột chết ở liều thử 4g/kg thể trọng và liều LD50 trong khoảng (5,872 – 7,978) g/kg thể trọng chuột cho thấy mức độ gây độc của CT-1 rất thấp.

Các kết quả chứng tỏ độ an toàn của CT-1 khá cao và có thể thử tác dụng sinh học trên chuột nhắt trắng ở các liều thử thông thường (0 – 1000 mg/kg thể trọng). Trên cơ sở liều LD50 và các kết quả thử tác dụng in vitro, chúng tôi thử tác dụng chống viêm cấp và mãn của chất CT-1 trên chuột cống trắng ở các mức liều 25 mg/kg/ngày và 50 mg/kg/ngày.

3.2. Tác dụng chống viêm cấp

Tác dụng chống viêm cấp của chất CT-1 được thử theo phương pháp gây phù bằng carrageenin trên chuột cống trắng. Kết quả thử tác dụng được trình bày trong Bảng 2 dưới đây cho thấy chuột uống chất CT-1 với liều 25 mg/kg/ngày không đáp ứng với quá trình viêm, không giảm viêm sau khi gây phù 3 đến 5 giờ.

Tuy nhiên, ở liều cao hơn 50 mg/kg/ngày, CT1 có tác dụng chống viêm cấp, với mức độ giảm lần lượt là 16,39 và 24,73 % (P<0,05). Kết quả này khẳng định chất CT-1 có tác dụng ức chế viêm cấp khi thử trên chuột cống gây phù bằng carrageenin ở liều uống 50 mg/kg/ngày.

3.3. Tác dụng chống viêm mãn
Kết quả thử tác dụng chống viêm mạn được trình bày ở Bảng 3.3 cho thấy chất CT-1 ở liều thử 25 và 50 mg/kg/ngày cho tác dụng chống viêm mạn với mức độ ức chế sự tạo thành u hạt lần lượt là 24,76% (p<0,05) và 23,25% (p<0,01) và đều có ý nghĩa thống kê. Có thể thấy tác dụng ức chế ổ viêm không phụ thuộc liều dùng của CT-1 trên chuột cống trắng ở 2 liều thí nghiệm.

4. Bàn luận

Đến nay, chất CT-1 mới chỉ được tìm thấy trong loài C. tonkinensis, chưa tìm thấy ở bất kì loài sinh vật nào khác, và chất này cũng là thành phần chính của dược liệu khổ sâm cho lá nên có thể coi CT-1 là chất đặc trưng cho loài C. tonkinensis [5]. Trước đây, tác dụng chống viêm của chất CT-1 đã được khẳng định thông
qua các nghiên cứu bằng mô hình thử in vitro, tuy nhiên chưa được khẳng định bằng nghiên cứu thực nghiệm.

Trong công trình này, chúng tôi tiến hành đánh giá tác dụng chống viêm của chất CT-1 bằng một số mô hình thực nghiệm để định hướng cho việc tiếp tục nghiên cứu hoạt chất này làm thuốc chữa bệnh. Trước tiên chất CT-1 được đánh giá độc tính cấp trên chuột nhắt trắng để xem xét mức độ gây độc và liều thử trong các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả cho biết LD50 của chất CT-1 theo đường uống là 6,925 (5,872 – 7,978) g bột/kg thể trọng chuột (ở mức p = 0,05). Như vậy, có thể thử các tác dụng dược lý của CT1 với mức liều <1 g/kg/ngày đối với chuột nhắt trắng và ở mức <100mg/kg/ngày đối với chuột cống trắng là an toàn và kết quả có thể tin cậy được [9].

Thử tác dụng chống viêm cấp của CT-1 theo mô hình gây phù chân chuột cống trắng bằng carrageenan, một mô hình kinh điển để đánh giá tác dụng chống viêm của một hoạt chất hay một dược liệu. Kết quả cho thấy CT-1 ở liều 50 mg/kg thể hiện tác dụng chống viêm cấp tại 3 và 5 giờ sau khi gây viêm và theo quan sát thì sau 24 giờ tác dụng chống viêm vẫn còn.

Tiếp theo, tác dụng chống viêm mạn của chất CT1 được thử theo mô hình gây u hạt bằng amian trên chuột cống trắng. Kết quả cho thấy chất CT-1 ở cả hai mức liều 50 mg/kg/ngày và 25 mg/kg/ngày đều có tác dụng làm giảm khối lượng u hạt trên mô hình này và đều có ý nghĩa thống kê.

Các kết quả thử đã khẳng định rằng chất CT-1 có tác dụng chống viêm cấp và mãn trên thực nghiệm, tuy tác dụng còn kém so với các chất đối chiếu dương là indomethacin và prednisolon (xem Bảng 2 và 3). Trong y học dân gian, khổ sâm được dùng để chữa bệnh viêm loét dạ dày tá tràng, các triệu chứng ngứa, ghẻ lở, đỏ ngoài da nên có thể chúng có liên quan đến tác dụng chống viêm. Và như vậy có thể xem xét rằng chất CT-1, một diterpenoid chính trong lá khổ sâm, là hoạt chất của dược liệu này.

5. Kết luận

Hoạt chất chính của lá khổ sâm CT-1 ở liều uống 50 mg/kg thể trọng có tác dụng ức chế viêm cấp trên mô hình gây phù bàn chân chuột cống bằng carragenin và có tác dụng chống viêm mạn trên mô hình gây u hạt thực nghiệm bằng amian ở chuột cống trắng với liều uống 25 mg và 50 mg/ kg thể trọng.

Kết quả cho thấy chất CT-1 có tác dụng chống viêm cấp và mạn và có thể xem xét rằng chất CT-1, một diterpenoid chính trong lá khổ sâm, là hoạt chất của dược liệu này.

Lời cảm ơn
Nhóm tác giả trân trọng cám ơn Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (Nafosted) đã tài trợ cho nghiên cứu này thông qua đề tài mã số 106-YS.05 2014.32.